显微镜的光学特性

传统的光学显微镜主要由光学系统及支撑它们的机械结构组成，光学系统包括物镜、目镜和聚光镜，都是由各种光学玻璃做成的复杂化了的放大镜。物镜将标本放大成像，其放大倍率M物由下式决定：M物=Δ∕f’物 ，式中f’物是物镜的焦距，Δ可理解为物镜与目镜间的距离。目镜将物镜所成之像再次放大，成一个虚像在人眼前250mm处供人观察,这是多数人感觉最舒适的观察位置，目镜的倍率M目=250/f’目,f’目是目镜的焦距。显微镜的总放大倍率是物镜与目镜的乘积，即M=M物*M目=Δ*250∕f’目*f;物。可见，减小物镜及目镜焦距将使总放大倍率提高，这是用显微镜可以看到细菌等微生物的关键,也是其与普通放大镜的区别所在。

那么，是否可以设想无限制地减少f’物f’目，以便提高放大倍率，使我们能看到更加细微的物体呢?回答是否定的！这是因为用以成像的光本质是一种电磁波，因而在传播过程中免不了产生衍射和干涉现象，就像日常所见水面的波纹遇到障碍时能绕行，两列水波相遇时能互相加强或削弱一样。当从一个点状的发光物点发出的光波进入物镜时，物镜的边框阻碍了光的传播，产生衍射和干涉，经物镜后无法再会集于一点，而是形成有一定大小的光斑，外围还有强度微弱并逐渐减弱的一系列光环，我们称中心亮斑为艾里斑，两个发光点靠近到一定距离时两光斑就会重叠，直至无法确认为两个光斑。瑞利提出了一个判定标准，认为当两光斑中心相距等于艾里斑半径时，两光斑是能分辨的，经计算，这时候两个发光点间的距离e=0.61入∕n.sinA=0.61入∕N.A，式中，入为光波波长，人眼可接收的光波波长约为0.4—0.7um，n为发光点所处介质的折射率，如处在空气中，n≈1，处在水中，n≈1.33，而A为发光点对物镜边框张角之半，N.A称为物镜的数值孔径。从上式可见，物镜能分辨的两点间的距离受到了光的波长和数值孔径的限制，由于人眼视觉最敏锐的波长约为0.5um，而A角不可能超过90度，sinA总小于1，对于可用的透光介质最大折射率约为1.5，故 e值始终大于0.2um，这是光学显微镜能分辨的最小极限距离。通过显微镜放大成像，若想将能被具有某些N.A值的物镜分辨率的物点间距e放大到足以被人眼分辨，则需M.e≥0.15mm，此处0.15mm为实验得出的人眼能分辨的置于眼前250mm处两微物间的最小距离，故M≥（0.15∕0.61