PCR问题，希望高手指点！！！！

来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/05/30 18:20:11
我用takara的LA taq扩一条4kb左右的片段，按照说明书给的体系扩50微升，但是条带并不是很亮，有些本来用普通taq能扩出来的居然没带，不知道哪里需要改进？
H2O 27ul
buffer 5
Mgcl2 5
dNTP 8
F 2(10uM)
R 2
cDNA 0.5
LAtaq 0.5
72度延伸2min，35个循环
希望得到有经验的朋友帮忙！！！！

cDNA 0.5 是 多少ng?
可适当增加点模板浓度

PCR最好设置成TD PCR（touch down）
每次温度递减0.7度
具体的循环参数可看参考书

片段还挺大的~是条带不亮还是没有？？可以通过降低退火温度增加pcr产物的多态性。

因为这种保证碱基的错配几率 所以效率相对普通的酶要低点 这两种酶的退货温度有点不一样哦 可以降低温度试试 或是换种高保真酶

大哥，你没写最关键的东西：退火温度，很难给你参考啊。
LA taq是很好的酶，但是4KB也不是短片段，如果你能保证你的引物设计没有错，那就该多在退火温度上下功夫。建议从52°开始试验，没有带就降低温度，全是杂带就提高温度。。。。如果还是扩不出来。。。恩。。。试试热启动吧，一般会有不错的效果：第一次95°的时候再逐管加入Taq酶。

BTW，以我做了4年PCR的经验来说。。。重新设计引物是王道