从大肠杆菌中制备少量质粒的流程

大肠杆菌质粒DNA的提取

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II（0.2 mM/L NaOH，1％ SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .

6、加入0.15m1预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇，混匀后于？0℃静置10min.

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中

煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中， 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml）， 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管