gbs生物活化素

生物素的活化与活化生物素的标记2007-01-12 03:33 1． 生物素的活化
生物素预先活化后，通过噻吩环的戊酸侧链上羧基与抗体、酶等生物大分子以酰胺键偶联。活化生物素的制备是获得高敏感度BAS制剂的关键环节。常用方法有以下几种：
1） 生物素N—羟基丁二酰亚胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制备：
取生物素1g混悬于12 ml，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0．6g N-羟基丁二酰亚胺(HOSU)和0. 8 g二环己基碳二亚胺(DCC)，置于密闭容器内，室温下磁力搅拌作用过夜。过滤，滤液经旋转蒸干。加10mL乙醚洗涤，继加200 ml异丙醇使其重结晶，获得白色粉末状晶体。
BNHS酯键中的-C=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基结合，使生物素标记在蛋白分子上，含赖氨酸残基越多，或蛋白质的等电点在pI 6.0以上，其标记效果越好。因此，BNHS适用于标记抗体及中性和偏碱性的抗原。
2）长臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制备
生物素的分子量仅为244.31，当与抗体或酶结合后应用于免疫试验时，极易受到大分子蛋白空间位阻效应(steric hindrance)的影响。使用长臂生物素可以减少位阻效应，提高试验的灵敏度。长臂生物素是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加2分子6－氨基己糖，犹如给生物素分子增添一只手臂，使其不受位阻效应影响，更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥作用、BCNHS的制备过程分为两步：先制成长臂生物素，然后再使其活化。
长臂生物素的制备：称取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖盐酸盐200mg，溶解于5mLDMF，再加入0.152 mL三乙胺(TEA)，室温搅拌下作用20h。蒸发去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，继加甲醇至溶液变清，搅拌2h。蒸发去甲醇，加10mL蒸馏水，搅拌下滴加浓盐酸酸化至刚果红指示剂恰好变色。室温静置2h后，移放冰箱过夜。收集白色固体物，干燥后用水重结晶，再经真空干燥，所得物即为长臂生物素，平均获得率为64％。熔点为206-215℃。
长臂生物素的