实时定量PCR引物设计

1，PCR引物是利用碱基互补原则，通过找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
2，首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列，一般NCBI、Genebank上都能找得到。
3，引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物3’端尽量不要出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，这样会会增加错配几率，3’端尽量不要以A为结尾； 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大； ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物 的载体的相应序列而确定。

我的做法是把A基因所属的基因家族进行blast。找出高度保守区域，设计引物
（长点，退火温度适当高点，特异性好些），把设计好的引物进行e-pcr，看有没有非目的扩增，如果没有，就ok
ps：如果你开始所说的其他基因和A有同源序列，那么他们该同类啊

实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化
http://bbs.biogo.net/read.php?tid=137120

详细图解：实时定量PCR引物和探针设计操作步骤
http://bbs.biogo.net/read.php?tid=137432

应该是要找该基因的保守序列，因为保守序列代表了该基因.特异序列有基因多态性，也许你的100个样本中有