3000bp的DNA如何分段设计引物

就我的感觉来说，2800bp不算长了。4k多的PCR我们这边很多实验室也做过，没什么问题。针对全长设计引物是合理的做法，因为分段的话后续步骤更多一些，比如酶切链接纯化什么的，那么引起突变或者降解的可能性就大些。

“第一次P出来了”是个什么概念？是仅仅有条带，还是已经测序正确呢？如果是前者，还是要确定一下它是不是杂带；如果是后者，那么就可以以它为模版继续扩增了。

以个人的经验来说，长片段PCR结果不好，首先考虑换条件（退火温度？离子强度？），其次考虑换酶（有的酶强些，有的酶弱些），再次考虑模版（如果是cDNA模版，它的质量很关键），再次考虑引物（软件并不是每次都可信，如果有文献报道过的最好）。作为一个并不算长的片段，分段是下策。

真的要分段，在中间找个酶切位点分成两段就好了，每段一千多，也就可以了。再多了实在没意义，后面还麻烦。注意这个酶切位点必须是在这2800bp中只有一个，而且在酶切位点前后设计引物比较容易。

比如说，EcoRI吧，那么P出来的结果是 5'- XXX......GAATTCXXX，和XXXGAATTCXX.....XXX -3'，然后酶切链接测序去吧。

祝你顺利。