UC知道高氯酸钠对dna提取的影响
来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/05/14 02:05:02
高氯酸钠对于放线菌的dna提取有没有影响啊？我们已经提了几天都没有出现dna沉淀，不明白他有没有破坏作用。。。 方法如下：1.5~2g湿菌体，加入20ml 1×TES，充分打散菌体
↓加入2mg溶菌酶
37℃水浴保温30-60分钟，温和摇动
↓加入2ml 20% SDS (终浓度为2%)
55℃水浴保温10分钟，然后冷却至室温
↓加入100μl蛋白酶K溶液
55℃水浴保温30-60分钟，温和摇动
↓加入5ml 5M NaClO4溶液
加入等体积(27ml) P:C:I混合液，充分振荡使其呈乳浊液，约30~60分钟
↓5000rpm，4℃，20-30分钟离心
用剪去枪尖的枪头吸取上层水相，转移至新的离心管中，重复用P:C:I抽提2-3次至没有蛋白膜出现为止
↓加入70μl RNase溶液
37℃水浴保温30-60分钟
↓
加入等体积的C:I混合液，充分振荡
↓5000rpm，4℃，20-30分钟离心
转移上层水相至烧杯中，冰浴，加入1/10体积预冷的3M NaAc-1mM EDTA-Na2及等体积的冷异丙醇，使DNA沉淀
↓用玻璃棒绕起DNA丝
望各位高手指点一二！！不胜感激。。
不是我们是进行了两次抽提，而且是将上清液提取出来后再加的酶处理，不要理解错了，能不能给一下进一步的解释呢？
大学生，试验方法是一个师姐的论文，我们用这种方法帮他完善，别的方法我也查过，现在我怀疑是加入异丙醇后冷藏的时间不够，我们就等了十几分钟，上清很透明就放弃了，这样吧，我再去试试，对了回来给你追加分！！不过先谢过了。。
↓加入2mg溶菌酶
37℃水浴保温30-60分钟，温和摇动
↓加入2ml 20% SDS (终浓度为2%)
55℃水浴保温10分钟，然后冷却至室温
↓加入100μl蛋白酶K溶液
55℃水浴保温30-60分钟，温和摇动
↓加入5ml 5M NaClO4溶液
加入等体积(27ml) P:C:I混合液，充分振荡使其呈乳浊液，约30~60分钟
↓5000rpm，4℃，20-30分钟离心
用剪去枪尖的枪头吸取上层水相，转移至新的离心管中，重复用P:C:I抽提2-3次至没有蛋白膜出现为止
↓加入70μl RNase溶液
37℃水浴保温30-60分钟
↓
加入等体积的C:I混合液，充分振荡
↓5000rpm，4℃，20-30分钟离心
转移上层水相至烧杯中，冰浴，加入1/10体积预冷的3M NaAc-1mM EDTA-Na2及等体积的冷异丙醇，使DNA沉淀
↓用玻璃棒绕起DNA丝
望各位高手指点一二！！不胜感激。。
不是我们是进行了两次抽提，而且是将上清液提取出来后再加的酶处理，不要理解错了，能不能给一下进一步的解释呢？
大学生，试验方法是一个师姐的论文，我们用这种方法帮他完善，别的方法我也查过，现在我怀疑是加入异丙醇后冷藏的时间不够，我们就等了十几分钟，上清很透明就放弃了，这样吧，我再去试试，对了回来给你追加分！！不过先谢过了。。
5ml 5M NaClO4溶液 是为了调节盐浓度DNA溶于高盐
55℃水浴保温10分钟，然后冷却至室温
↓加入100μl蛋白酶K溶液
55℃水浴保温30-60分钟，温和摇动
水浴60℃保持最少1 h，不时摇动
你这步骤相信也是从书上抄来的 看看有没有抄错 如果是正规的教科书应该都是别人试过的 不会有问题的 不过相信这方法比较古老了 提取的效率不会太高的
你是高中生还是大学生?如果有条件的话可以用用以下方法 我们一般是这样提的每每成功的 不过最后看到的不是DNA丝 是沉淀
用用SDS法
1. 研磨，加入0.4ml提取buffer,充分混匀。
提取buffer：0.4 M NaCl2, 10 mMTris-Cl(pH8.0), 2 mM EDTA。
2. 加入0.04ml 20%的SDS（终浓度2%）、0.008ml 20mg/ml的蛋白酶K（终浓度400g/ml），充分混匀。
3. 水浴60℃保持最少1 h，不时摇动， OR overnight 。
4. 随即加入0.3ml 6M的NaCl2,剧烈涡旋震荡30s。
5. 转速12000rpm离心10min。
6. 将上清转移入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀；放置-20℃保持1 h
7. 转速12000rpm离心10min，弃去上清，DNA沉淀用70%的乙醇洗1-2次。
8. 常温干燥、将残留乙醇挥发完，加入0.3ml ddH2O溶解DNA；可以立即用于PCR分析或放置-20℃保存。
PCL抽两次最多了，苯酚对DNA的伤害很大，有时候我抽植物都不用苯酚。抽完了用CL再抽一次，为的是除去苯酚，像你们那样苯酚还在溶液里就37℃保温，DNA不断光才见鬼呢。