cDNA浓度的测定

来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/06/17 13:22:21
最近在做RT-PCR，遇到一个很纳闷的问题，扩增出来目的基因和内参都存在，而且条带也不错，但是组与组之间却没有什么统计学意义（按文献，应该是有递增趋势的），我已经降低了cDNA加入的量、减少PCR循环次数但是仍没有得到想要的结果，不知道是不是在PCR前也要检测一下cDNA的浓度，并等质量上样跑PCR呢？望高手指点，小弟感激不尽！

理论上讲，等质量是必要的。
但是就反转录结果而言，里面的成分太多，测量浓度的误差比较大。

我们实验室一般都是测量RNA的浓度，然后取等量RNA、过量oligo dT做充分反转录，再取等量反转录体系做PCR。

另外，我看你用条带定量？这样很不准确，因为你也不知道PCR多少循环后达到饱和。比方说，组间差8倍，差异很明显了，但也不过就差3个循环而已。你说减少了PCR循环数，但是也不能保证减少到合适的程度。一组在10个循环饱和，一个在13个循环饱和，你从20个循环减少到15个循环，条带还是一样亮。

强烈建议做Real-time PCR，用实时定量曲线去看组间有没有变化，这样就没有循环数的问题了。另外，由于内参的存在，也就没有cDNA浓度问题了。

祝实验顺利。