请问:怎样提取微生物的质粒(DNA)?

来源:百度知道 编辑:UC知道 时间:2024/06/21 05:48:00
请问:怎样提取微生物的质粒(DNA)?

碱提法:
一、试剂准备
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ:0.2N NaOH,1% SDS。2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8。5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
4. TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml,0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
6.乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
7. 5×TBE:Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
8.溴化乙锭(EB):10mg/ml
9.RNase A(RNA酶A):不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer(上样缓冲液):0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样。
二、操作步骤
1. 挑取