超长引物PCR

1.PCR反应的成功与否不与oligos的大小直接相关，主要看你的primer与模板特异性结合序列有多少个碱基对。虽然你的引物有97bp长，但和模板结合的位置可能仍旧只是20-30bp左右，计算退火温度时，只拿这20-30bp计算就可以了，你引物剩下的序列，只是为了引入信号肽和his标签而已。（你可以想想在做引入突变位点的pcr时，第二部反应其实就相当于两个DNA模板互为引物进行反应，那么每个引物都可以有上千bp长，也没有关系）。

2. 检查引物有没有回文序列，和连续超过6bp的单一碱基重复序列，检查两条引物是否互补。如果都没有，就可以了。

3. 问题在于，定制97bp的引物，每个碱基的单价就很贵，而且需要做purify，定制起来价格比较昂贵，我不知道国内什么价格，在美国，这样一个引物大约需要150美元左右（绝对要做purify）。如果需要降低成本，只能做两次PCR，譬如说，第一次先加上信号肽，第二次pcr再加上his标签。

4. pcr反应按照普通设置即可进行。如果你引物都这么舍得肯花钱，推荐你一个非常NB的pcr kits，叫做phusion. http://www.bioke.com/blobs/Finnzymes/PhusionHigh-FidelityMasterMix.pdf
效果惊天地，泣鬼神。

我认为1楼的回答可能存在一些问题。

首先引物是否合适这个首先必须满足常规引物的需求，比如避免发夹结构，这些1楼说得比较清楚。

但是我认为在程序设置上1楼说的可能存在一些问题。

1首先在第一个循环中，两个引物和模板配对的片断确实是根据你设计的除去信号肽和his标签的部分。大约为2，3十个base。当你完成第一个循环之后有1/4的链加上了上游引物（标记为A链），有1/4的链加上了下游引物（标记为B链），。
2.在第二个循环中你应该是希望通过A链复制出含