硝酸还原酶的测定方法

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，它与作物吸收和利用氮肥有关。NR作用于NO3-使其还原为NO2ˉ：
NO3ˉ+NAD(P)H+H+→NO2ˉ+NAD++H2O
产生的NO2ˉ 可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即可表现NR活性的大小。
NO2ˉ含量的测定采用对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）比色法。在酸性溶液中对氨基苯磺酸与NO2ˉ 形成重氮化合物，该重氮化合物在进一步与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在pH 7.5时540 nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定其光吸收值，从而间接测得溶液中的NO2ˉ的量。这种方法非常灵敏，能测定每mL含0.5 μg的NaNO2。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以 μg NO2ˉ /( gFW· h )为单位。
一、仪器、药品与材料
　　（一）实验材料
新鲜的植物叶片（如豌豆、王米、小麦、大豆等）。
　　（二）仪器与用品
50mL三角瓶、打孔器（直径 0.5 cm）、真空泵、温箱、分光光度计、移液管 （5mL 3 个、 1 mL 2 个、 2 mL 2 个）、天平 1 台。
　　（三）试剂
1．1%对氨基苯磺酸：称取1.0 g对氨基苯磺酸溶于 100 mL 3 mol/L HCl 中（25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL ，即为 3 mol/L HCl ）。
2．α-萘胺试剂：称取0.2 g α-萘胺，用含1 mL浓盐酸的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至100 mL。
3．NaNO2 标准液：称取 0.1 g NaNO2，用蒸馏水溶解后定容至100 mL。吸取其中5 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL。此溶液每毫升含有5 μg NaNO2，用时再根据不同需要稀释。
4．0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 2.002 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
5．0.1mol/L磷酸缓冲液，pH 7.5：见附录7。
二、实验步骤
1．将新鲜取回的叶片洗净，用