我要设计出能扩增出小鼠TSLP全长的引物,但模板3'端的GC含量太低了该如何解决

你是说3‘是AATAA，觉得GC低了吗？

你要p全长，是要3’和5‘序列么

通常pcr cDNA全长，是分别pcr 3’和5’端，然后2部分拼起来，用的是片段中部的序列特异引物，和RTpcr末端的专用引物（跟序列无关，跟RT用的方法有关）

做全长是比较困难的pcr，如果你要求不是太苛刻，只需要中间就够了（不要3’5‘序列），那3‘的GC高低对pcr无任何影响，因为引物重要的是3’端头几个，5‘影响基本没有。

我估计你是把引物分别设计在3’和5‘，然后主要p中部，这样得到的只是中部的准确序列，（2端是引物序列），如果不是测序而是仅作检测的话是可以了。嫌3’低了，往上游移动下。

另外GC低不怕，高才可怕。
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原核表达么？
那挺复杂的，问师兄师姐以前怎么做的。

3'GC低不怕，只要全长p出来，测序成功，ok。
你上下游引物差多少，5度内没什么问题。
我肉眼看GC差不多，不太离谱
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Primer Premier 5的一个,oligo6算的Tm
fo:gaattcATGGTTCTTCTCAGGAGCCTCTTC Tm=56.2
re:ctcgagTTATTCTGGAGATTGCATGAAGG Tm=55.7
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oligo 算Tm当然是加上了酶切位点算的。
Tm（CG值）怕高不怕低，Ta用Tm下5～10度尝试。
CG40%～60%，Tm55～65都是很正常的范围。
除非你的pcr对Tm有较高的要求，如realtime。
pcr成败是引物本身特异性结合情况，其中Tm是重要的，但不是绝对的和最重要的。
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保护碱基看你用的什么酶切的了。买的酶的公司网站