急求!!!TCA可溶性蛋白(短肽)的测定方法!!!

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植物体内可溶性蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝法

原理

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

试剂

（1）牛血清白蛋白 配成100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；

（3）90%乙醇；

（4）磷酸（85%，W/V）。

方法

1.标准曲线的绘制

（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液

管 号
1
2
3
4