询问PCR退火温度设计

TM值是在一定buffer盐浓度情况下计算出来的。你需要查一下你的PCR体系里buffer盐的浓度，然后找相应的TM值。不过TM值也是一个估算值，举个例子，以你的正向引物而说，TTACAAGATGGAGCCTCACC。在primer5计算得到TM是54.0， DNASTAR是49.1.所以这个数值仅供参考，最稳妥的做法是用梯度PCR仪从55-65做一个梯度PCR。
PCR能不能做出来最关键的因素有两个，第一，模板质量如何，第二，引物3'是否有错配，gc含量如何。如果错配不严重的话，采用无脑梯度pcr的方法总能找到一个合适的退火温度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

我也遇到了这种情况，我选择了与我用的酶的buffer中离子浓度相近的温度。结果挺理想。

但咱们做这个都知道，引物单子上给出的温度跟基因实际的扩增温度有一定差距。所以需要做温度及模板的梯度试验。

另外，我也会综合primar5 上给出的结果。

总之，一定要做梯度。