请教免疫组化的具体步骤！

一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ：

1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）

12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）

14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ：

（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育