加减法DNA测序整个过程和化学测序的过程(最好有图片说明)

来源:百度知道 编辑:UC知道 时间:2024/05/08 09:28:54
希望那位的大虾 帮帮小弟啊 实在不懂 啊 呵呵 能说清楚最好了

以下都是思路,具体的反应和实验细节,假如思路清楚后,随便找一本实验书就可以明白。这两种方法,思路上很简单,很多教科书,特别是实验书上都有图可参考。因为不懂,所以更要多看多翻多想。
【下面的回答,有谬误,请大家指正和完善】
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加-减法(plus-minus sequencing): Sanger于1975年发明,使人们有可能第一次“读”出DNA的碱基序列。

首先,在做“加法体系”和“减法体系”以前的工作。
待测DNA的单链作为模板,一个合适的引物,四种dNTP,用同位素标记。
DNA聚合酶从引物开始合成一条互补链,理想情况是,合成所产生各种长度的片段都存在。
然后除去那些未参与合成的dNTP,将剩下的合成产物,分成两部分。
一部分用于加法系统,一部分用于减法系统。

加法系统:将用于加法系统的产物再分成四小份,每一小份中仅仅将四份中的dNTP的一种加入反应体系。比如仅加入dATP。由于DNA由聚合酶具有3′→5′的外切酶活性,而反应体系中缺少另外三种必要的dNTP,合成产物就从3′→5′方向降解。然而由于存在dATP,显然遇到dA的位置降解反应就停止了。因而所有的片段都是以A结尾的。同理,可以分别制备以C、G或T结尾的另外三组片段。
四组片段在同一块凝胶板的不同样品槽中同时电泳(这类图LZ可以在书上随便找到),从放射自显图上就可以推断出碱基序列,因为从A样品槽查出的放射性区带代表A在片段中的位置,同理也可定出C、G和T的位置。
【加法系统实际就是以降解为条件,以DNA聚合酶的3′→5′的外切酶活性为基础,当降解过程遇到试剂中所富含的dNTP时,反应就停止】

按理只用一个加法系统就足以推断DNA的碱基序列了。但由于技术上的原因,只用一种方法有时不能得到完全正确的结果,因此又设计了一种减法系统。

减法系统:也是将上述酶促产物分成四小份,每一小份中只加入三种dNTP,比如缺少dATP。在这个反应体系中,DNA聚合酶能够把片段继续合成下去,但是在