连接和转化！

来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/06/18 09:50:16
PCR产物的大小大约2000bp，连接用的载体是PMD18-T，16度过夜（约13小时），加入感受态冰上30min后42度热激90s，冰上3min。然后涂平板，过夜，挑菌落。做菌液PCR检测，挑了二十个只有两个转入了片段，其余均为质粒自身片段的大小。
1.连接效率为什么这么低？不知道什么原因。是不是PMD18-T不适合连接大的片段？还是其他有什么要特别注意的地方？
2.菌液PCR产物电泳检测时，发现两个阳性的片段大小更靠近MARKER的1000bp处，而与2000bp差的较远，这是什么原因？
求达人解惑！

1.连接转化效率本来就很低。特别是照搬别人的条件的时候。你可以提高效率，那就需要自己摸索条件，不过反正有阳性，不就行了？多了你也没用。
2.电泳的结果我觉得不可靠，万一质粒引物在目标片段上有结合位点呢？我连接后都是PCR然后测序检测，25块钱么。