PCR如何扩增大片段质粒??

来源：百度知道编辑：UC知道时间：2024/05/28 05:29:07

我要改造一个质粒,大小为10KB,目的是让质粒中的一个基因发生移码突变,因此我想在这个基因内部设计特异性引物,该引物与模板存在一到两个碱基的差异,我想通过这对引物来括增整个质粒,从而实现改造的目的.但是PCR括增大片段都不行,请问我在引物设计和PCR程序设计时应该怎么做才能实现我的目的??

设计一对引物，针对基因两端（覆盖酶切位点），在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基，扩增以后，酶切产物和空载体，再连接一遍，转化，小提拿去测序。
最好上游换另一个内切酶位点，这样方便双酶切检测，区别于原来的质粒。

有模板，引物，聚合酶就可以了

如果基因已经已知，那还为什么要在质粒上改造？切下来在单独作突变好了，然后再联回去。突变的话就用重叠引物pcr好了，可以较容易的加几个碱基。扩增大片断的话可以购买东洋纺的专门扩增长链DNA的试剂盒好了。