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来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/05/26 13:50:00
Recombinant Heparinase (r-Heparinase). r-Heparinase was expressed using the pET system (21), where expression is driven by bacteriophage T7 polymerase. The host E. coli strain BL21(DE3) contains a chromosomal copy of the T7 polymerase gene under the control of lacUV5. The expression is induced by isopropyl f3-D-thiogalactoside. Two constructs were designed to express heparinase in the pET system. The first construct included the native heparinase leader sequence. The second construct started with a sequence that read Met, Gln22, Gln23, Lys24, Lys2s, Ser26 ....
The Met residue was added before the Gln22 to introduce a start codon. Nde I and BamHI restriction sites were appended onto the 5' ends of the N- and C-terminal primers, respectively. F. heparinum genomic DNA was used as a template for 10 scaled-up PCR cycles (see Amplification of the PCR Product) to generate the modified heparinase I product. The PCR product was isolated as discussed above and concentrated using a Centr

首先,祝你全家平安,并且鄙视楼上骂你疯的人,低修养!!!

Recombinant Heparinase(r Heparinase)。 r Heparinase被使用pET系统(21)表示，在那里T7 polymerase噬菌体驱赶表示。 主人E. coli劳累BL21(DE3)包含一染色体T7 polymerase基因在lacUV5的控制下。 异丙基f3-D-thiogalactoside 引起表示。 两结构被用于在pET系统里表示heparinase。 第一个结构包括本地heparinase领导人顺序。 第2 结构从遇见的读的一个顺序，Gln22，Gln23，Lys24，Lys2s，Ser26开始 ....
在介绍开始codon的Gln22之前见面的残渣被增加。 Nde I 和站点限制BamHI被附加到那些5上'，末端的那些N的和C 末端入门，分别。 F. heparinum genomic DNA 为10个向上攀登PCR 循环(看见PCR 产品的扩大)被用作一个模板产生被修改的heparinase I 产品。 PCR 产品被象在上面讨论并且集中以5000 x 克使用一Centricon P-100(Amicon)20分的那样隔离。 这种扩大产品被用DNA polymerase I(新英格兰Biolabs)的Klenow碎片处理15分并且用T4 DNA polymerase(新英格兰
10分Biolabs)。 PCR 产品被象在上面描述的那样在agarose 凝胶上隔离。 钝PCR碎片集中使用一Centricon P-100 和ligated与Sma我领悟pUC18(Pharmacia)(19)20 ng一起。 ligation 混合物用于改变有能力DH5a的小屋(GIBCO / BRL / 生命技术)，象由制造商推荐的那样。 Subcloned heparinase PCR碎片被Nde因为消化被从pUC18删除我和BamHI，净化的凝胶， 以及pET-3a plasmid(在Nde I预先处理，BamHI 场所和凝胶净化)的ligated使用T4 DNA ligase(新英格兰Biolabs)。 ligation 混合物然后用来改变有能力DHSa的小屋。 包含heparinase I基因的plasmid在