反转录的实验步骤

你按照买的反转录试剂盒来做就行。

（1）、从细胞中提取细胞总RNA
用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA。按试剂使用说明操作:离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞)，混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液，不粘稠时为止。随后加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒钟，室温放置5分钟，然后，4 0C ,12000rpm离心5分钟，将上层水相转移至一Eppendorf管中，加入500ul异丙醇后混匀。4 0C , 1 5000rpm离心15分钟，倾出异丙醇。用70%乙醇洗涤沉淀一次，置冰上，让残余乙醇挥发殆尽。溶于适量的DEPC水中，紫外分光仪测定RNA的纯度及含量，分装冻存于一700C保存.
（2）、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)
在20ul体系中，加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水，70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种)，混匀后于42℃保温2分钟，加入1ul( 200U)的反转录酶，42℃继续温育50分钟。700C 15分钟灭活反转录酶。
（3）、 引物设计
(4)过程: 以1ulcDNA为模板，在50ul体系中含有Taq酶为2单位，dNTPs浓度为200uM，引物各为0.2uM。扩增22个循环。取8ul电泳。

1、从细胞质中获得RNA
2、以该RNA为模板按照碱基互补配对为原则反转绿得单链的DNA
3、以得到的DNA为模板碱基互补配对为原则反转绿得双链的DNA