UC知道帮忙分析PCR的问题
来源：百度知道 编辑：UC知道 时间：2024/09/24 20:18:55
为什么酶切后，就扩不出东西来？更改了好几次退火温度
我之前将酶切过的cDNA片段定向(5'-3')加上上接头后,加接头的位置在酶切位点.
然后，选择一段没有被酶切的持家基因设计引物。利用不同的模板进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果如下图：
描述：最左侧的一条带大小约500bP，为未进行酶切的cDNA扩增产物。大小与设计的片段序列片段吻合。证明扩出来了。
其余两条带为酶切后加不同接头的两个模板扩出的产物。
条件补充： 所用酶 RSaI ；退火温度为56度。
问题：1为什么酶切后就扩不出东西？难道接头对持家基因上的引物扩增也有影 响？
2解决方法还请赐教。
我之前将酶切过的cDNA片段定向(5'-3')加上上接头后,加接头的位置在酶切位点.
然后，选择一段没有被酶切的持家基因设计引物。利用不同的模板进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果如下图：
描述：最左侧的一条带大小约500bP，为未进行酶切的cDNA扩增产物。大小与设计的片段序列片段吻合。证明扩出来了。
其余两条带为酶切后加不同接头的两个模板扩出的产物。
条件补充： 所用酶 RSaI ；退火温度为56度。
问题：1为什么酶切后就扩不出东西？难道接头对持家基因上的引物扩增也有影 响？
2解决方法还请赐教。
最可能你的cDNA内部含有酶切位点，建议仔细检查，这种可能性最大。另外楼上说的内切酶Star活性也是有可能的。
另外，如果检查上面的问题没错之后，建议把退火温度降低到52度试试。
另外加接头以后，有可能出现非特异性互补，造成引物错配，建议用加上接头的序列进行引物互补分析。
从你的电泳结果看，酶切并连接接头后，管家基因的扩增片段变小了，并且有些呈现弥散状。
你考虑下是否是内切酶具有星活性造成管家基因的cDNA被切割。
应该是没有影响吧~你的这个退火温度是不是有点高啊~
唉，我这几年生物学的~帮不上你什么忙啊~
检查一下引物，重新算一下它的退火温度，因为某些生物合成公司的温度计算有出入，建议跑个梯度PCR（50-60度）
你做的是什么啊？抑制消减杂交？