问一个分子生物学的问题，片段连接

我有一条60bp片段，两边有两个不同酶点，想让它尽量的连接，越长越好（20条以上最好），请教方法，最好附上参考文献，谢谢
如果只是蹭分数的话，那就请绕过，回答的好有价值的话高分重谢
或者直接说，我需要文献的证明，这样老板才给做这个实验呀><！拜托大家了！

A-（B-A）n-B

A-（B-A）n-A

B-（A-B）n-B

A,B为酶点

难点：1，PAGE回收效率低，步骤要尽可能少；

2，n尽量的多

你的目的就是要制造一个中频重复片段是吧？
那么你的两端的酶切位点是什么呢？还有你想获得的是同向的重复序列还是随机方向的重复序列呢？如果是随机方向的重复序列，那比较方便，即补平末端加连接酶长时间做平头连接即可获得重复序列。如果不是的话，那么就很难达到你要的目的了。

60bp太短了，跑琼脂糖不行
要么你跑PAGE回收，要么你设计一条跟它互补的链，然后退火，再连接到载体上
至于你说“想让它尽量的连接，越长越好”，我不太理解是什么意思。是要这60bp的重复片段吗？可以加我百度好友，讨论下

1.片段略长了些，增加了连接的难度，建议连接时控制一下载体和片断的摩尔比例1：3～1：10，载体的量尽量少些。
2.你的片段如果是PCR产物双酶切后用于连接，建议酶切时间长一些，以保证能完全切开，也就是说你得连接过程要保证没有问题。
3.如果一种感受态菌株不行的话，建议你试试其它菌株。
4.你得片段加上载体有将近10k的大小，化学转化方法对于大质粒转化效率要低一些，你可以尝试一下电转化，祝你好运！

你是做的双酶切还是单酶切?一般来讲单酶切插入目的片断的话就需要去磷酸化载体以避免自连.我现在正在构建一个单酶切连接的载体,所以觉得有些东西可以大家探讨一下. 我觉得连接是CIAP 去磷酸化处理不能完全反应,也就是说肯定有一部分载体是不能被去磷酸化的,理论上,连接后转化应该有部分自连的产物,你做了很多次一个转化子都没有长出来, 而且你的感受态转化效率也不低,可以考虑换下连接酶,而且连接时候载体和目的片断的比例可以再低点,尽可能减少自连,连接温度可以试试16度或者22度,时间长点无所谓,转化的时候冰浴时间也不用局限于30分钟以内,可以再长点.
我也构建了一些载体,总的来说我觉得双酶切比单酶切好,单酶切不仅自连比较多给筛选增加负担,另外还有可能是反向插入,建议最好是双酶切插入目的片断比较好.
祝你成功!

谢谢楼上的建议。我做载体的时候是用的单酶切，昨天我又做了一个，这次在酶切载体的时候酶切不完全，我就直接回收用了，在今天的平板上就长菌了，而且量还不少，但我觉得极有可能是没有切开的质粒长的。为什么6.8k的都能长，10k的就长不了呢？