LA Taq pcr的问题

来源:百度知道 编辑:UC知道 时间:2024/06/13 23:36:08
我用LA Taq 扩增一个长度大概1300bp的序列 然后去测序 出了很多错配不说 还居然多了一个碱基~ 这是怎么回事??反应条件不合适吗?

LA Taq是一种保真度非常高的DNA聚合酶,出现这样的问题你应该在自己的PCR反应体系组分以及循环条件上找原因,当然还是老方法——排除法。

pcr和测序都可能出错:
PCR特异性如何,有没有杂带?用什么测序,PCR产物还是质粒?纯化没有?浓度够不够?
测序图谱好不好?错配集中在一处还是分散?附近有没有特殊结构,如简单重复、回文?是在测序反应末端吗?

如果1300bp的片段都能出现很多错配的话,建议你检查你的LA Taq的质量。一般普通的Taq在正常条件下1KB片段也才出现2~5个错配。

一般来说,测序结果很少出错的。建议你从一下几个方面着手:
1 给出的测序结果可能是你基因的互补链,所以当你比对的时候就会显示很多错配的,你用反向互补序列再比对下。
2 你的序列需要两个反应,多出的可能是序列拼接的时候出的问题,你对照测序图谱看下,在两个反应的交叉位置。
3 若上面的原因都不是,若你PCR的效果(条带的亮度,大小,特异性)都很好,那就是你引物特异性的问题了,这个好好核对下。